Анализ и оптимизация противогрибковых свойств композиционного материала из полиуретана (PUR) и наночастиц серебра (AgNP) в отношении грибка Trichophyton Rubrum. Часть 1

Анализ и оптимизация противогрибковых свойств композиционного материала из полиуретана (PUR) и наночастиц серебра (AgNP) в отношении грибка Trichophyton Rubrum.

Целью данного исследования является анализ и оптимизация противогрибковых свойств композиционного материала из полиуретана (PUR) и наночастиц серебра (AgNP) в отношении грибка Trichophyton Rubrum, чтобы найти оптимальные параметры, позволяющие максимально ингибировать рост грибков для использования в здравоохранении. Нацелен на людей, уязвимых к грибковым инфекциям, например, страдающих сахарным диабетом, создавая тем самым возможность для тзготовления противогрибковых продуктов. В этом исследовании анализируется влияние трех переменных на противогрибковые свойства композиционного материала: размер наночастиц, концентрация и применение ультразвуковой обработки как метода, способствующего диспергированию AgNP в матрице PUR. Предлагаемая методика включает испытания по стандарту для оценки ингибирования роста грибов на культуральной среде. Модель категориальной логистической регрессии была скорректирована на основе 23-факторного плана с пятью повторами, который был оптимизирован с использованием многокритериальных генетических алгоритмов. Экспериментальные факторы показали существенное влияние на ингибирование роста гриба, и были определены оптимальные уровни.

Введение

Нанотехнологии — новая область научных исследований с широким спектром применений в микробиологии и биотехнологии . Наночастицы серебра (AgNP) представляют собой агрегаты из относительно небольшого числа атомов: от небольших размеров, состоящих всего из нескольких атомов, до более крупных наночастиц, содержащих более 100 000 атомов. Кластеры представляют собой тип наночастиц масштаба нанометров, содержащих небольшое количество атомов; их свойства отличаются от свойств как молекул, так и атомов и очень зависят от размера. Рассматриваются два размера AgNP.

AgNP обладают уникальными физическими и химическими свойствами, такими как адсорбционная способность, быстрая скорость диффузии и изменение характеристик поверхности. Их применение в нанобиотехнологиях, биосенсорах, визуализации клеточных структур и адресной доставке лекарств хорошо известно . Биологические ресурсы, включая бактерии, растения, водоросли, грибы и биомолекулы, оказались отличными кандидатами для синтеза AgNP. Для определения многочисленных свойств, а именно размера, геометрии, формы, кристалличности и площади поверхности, можно применять различные методы, включая просвечивающую электронную микроскопию (ПЭМ), сканирующую электронную микроскопию (СЭМ) и УФ-видимую спектроскопию.

Интересным свойством AgNP, о котором сообщается в литературе, является биоцидная способность против различных типов микроорганизмов, которая будет тщательно проанализирована в разделе, посвященном современным технологиям. В этом исследовании особый интерес представляет анализ способности композитного полиуретана и материала AgNP ингибировать рост грибка Trichophyton Rubrum, что может обеспечить потенциальное применение продуктов, способных ингибировать пролиферацию грибов Trichophyton, ответственных за такие заболевания, как опоясывающий лишай стоп.

ПУР считается одним из наиболее универсальных полимерных материалов благодаря широкому спектру материалов с различными свойствами, которые можно получить из него, например, жестких и гибких пенопластов, покрытий и термопластичных материалов. В последние годы благодаря своей превосходной химической стабильности, биосовместимости и низкой цитотоксичности некоторые полиуретаны нашли широкое применение в биомедицинских целях . Текущие медицинские исследования PUR сосредоточены на новом подходе: металлы, такие как серебро, и наночастицы оксида меди. Таким образом, предлагаемая методология исследования ориентирована на использование полиэфирного полиуретана и наночастиц серебра разного размера для получения композиционного материала с противогрибковыми свойствами. Исследования AgNP являются относительно новыми и  способствуют применению наночастиц в полимерных материалах, несущие потенциальную пользу для человечества: возможность применения композиционного материала ПУР и AgNPs для получения изделий (таких как, например, стельки), которые могут использоваться людьми, постоянно подвергающиеся воздействию грибов семейства Trichophyton, которые весьма заразны.

Свойства AgNP против микроорганизмов и грибов.

Линима В.К. и др. сообщают о весьма многообещающих антимикробных, противовирусных и противораковых свойствах использования AgNP, включая антибактериальную и противогрибковую активность против Salmonella typhi, Staphylococcus aureus и гриба Aspergillus flavus. По данным лабораторных исследований, бактерицидная активность AgNP в отношении Staphylococcus aureus и Escherichia coli может быть связана с высокой концентрацией наночастиц; однако очень высокие концентрации могут вызвать токсичность. Другие микроорганизмы, такие как Pseudomonas stutzeri, продемонстрировали устойчивость против AgNP.

Было продемонстрировано, что AgNP являются эффективным противомикробным средством против множества патогенных микроорганизмов, таких как гриб Aspergillus flavus, при этом сообщалось о положительных результатах биологического синтеза в лаборатории. AgNP, полученные биосинтезом с использованием гриба Aspergillus melleus, проявляют антибактериальную и цитотоксическую активность в отношении S. aureus и E. coli, что создает прочную основу для противогрибкового фармацевтического и косметического применения на основе биосинтезированных AgNP.

AgNP продемонстрировали свойства, подавляющие рост различных типов грибов, включая Aspergillus fumigates, A. niger, A. flavus, Trichophyton rubrum, Candida albicans и Penicillium spp. Согласно современной гипотезе, AgNP изменяют проницаемость клеточной мембраны, тем самым вызывая гибель клеток за счет производства активных форм кислорода (АФК) и свободных радикалов, которые вызывают денатурализацию и повреждение нуклеиновых кислот, протонного насоса и клеточной стенки, а также как перекисное окисление липидов.

Форма наночастиц и их применение в полиуретанах.

Сообщается, что морфология AgNP является важным фактором для оценки антимикробной активности, а наиболее распространенные формы включают пластинки, стержни и наночастицы. Эффекты этих морфологий были протестированы на S. aureus и E. coli. Пэт и др. изучали антибактериальную активность сферических, палочковидных и усеченно-треугольных AgНЧ в отношении E. coli; их результаты показали, что нанотреугольники обладают самой высокой биоцидной активностью, за ними следуют наносферы и наночастицы в форме стержней. Как отмечалось, оценка морфологии очень важна для нанометрических систем. Клеточная токсичность также связана с размером наночастиц, который крайне важно учитывать при разработке AgNP для биомедицинских применений .

В исследовании материалов применение AgNP в полимерах и последующая визуализация с помощью методов SEM позволили нам подтвердить эффективность их антибактериальной и противогрибковой активности. Исследования термопластичного полиуретана (ТПУ) с включенными AgNP успешно оценили противовирусную активность композиционного материала против весенней виремии вируса карпа (SVC) и SARS-CoV-2 [36]; аналогичным образом были разработаны порошковые покрытия из полиуретана с AgNP в качестве биоцидного агента, продемонстрировавшие эффективность против вируса SARS-CoV-2.

В литературе сообщалось о концепции активного полиуретана с AgNP и наночастицами меди (CuNP). Приготовление композиционного материала описывается как смешение жидкого полиэфира (мономера для синтеза полиуретанов) с компонентами серебра и меди с последующим синтезом полиуретана; это позволяет рассматривать данные материалы как изделия медицинского назначения, обладающие биоцидной активностью, поскольку образцы не проявляли цитотоксичности в отношении тестируемых клеток в культуре ткани (гиподерма крысы) и в культуральной среде не наблюдалось продуктов биодеградации .

Материалы

Были оценены AgNP двух разных размеров, диспергированные в этаноле, со средним диаметром 15 и 45 нм, которые были получены от местного поставщика NABICRON (Ирапуато, Мексика).  Методика была реализована в специализированных лабораториях с соблюдением параметров и процедур стандарта ASTM-G21-15-4. Методика исследования представлена на рисунке.

Предлагаемая методология.

Определение экспериментального плана

Экспериментальный массив, использованный для исследования, представляет собой факторный план 23 с пятью повторами. Этот экспериментальный план позволяет изучать влияние трех различных факторов с двумя уровнями каждый и состоит из восьми различных методов лечения. Используя эту схему, можно изучить семь эффектов: три основных, двойное и тройное взаимодействие. Цель исследования направлена на анализ влияния следующих факторов: размера AgNP либо низкий-маленький 15 нм-, либо высокий-большой 45 нм-; концентрация наночастиц с низкой концентрацией 5 г дисперсии AgNP/этанол и высокой концентрацией 10 г дисперсии AgNP/этанол; и применение ультразвуковой обработки полиола для дисперсии AgNP с низкими уровнями -0 с и высокими -10 с. Экспериментальная матрица представлена в таблице 1.

Таблица 1. Экспериментальная матрица.

Ценности

  соответствуют категориальной количественной оценке, связанной с уровнем ингибирования роста грибов в культуральной среде, окружающей композитный материал ПУР и AgNP. Каждую обработку и ее повторы проводили трижды и использовали среднее значение трех наблюдаемых ростов для каждой обработки. Из-за нитевидной морфологии изучаемого гриба количественно оценить его с помощью инструментов обработки изображений было невозможно; поэтому было решено использовать категориальный тип ответа, оценивая по категориям на основе роста, наблюдаемого с помощью микроскопа.

 Базовые приготовления

Для каждого экспериментального образца отвешивали 44,69 г предварительно нагретого до 40 °С полиола (содержащего дисперсию AgNP/этанол) и 34,86 г изоцианата, для завершения рецептуры полиуретана добавляли 0,45 г катализатора, учитывая, что эти элементы не должны перемешать до желаемого вспенивания полиуретана. На рисунке 2 показан процесс взвешивания каждого составного элемента полиуретана.

Получение композиционных материалов PUR/AgNPs

Предварительно нагретые и взвешенные полиол и изоцианат сливают в емкость и сразу добавляют катализатор. Смесь помещают на лопасти механического миксера на 10 с до изменения цвета на бледно-серый. После этого образец вынимают из миксера и оставляют для вспенивания, оставляя его в покое минимум на один час для лучшего результата. Этот процесс показан на рисунке 4.                                                                                                                     Рис. 4.

Характеристика композитных материалов PUR/AgNPs

Дисперсию AgNPs охарактеризовали с использованием эмиссионного сканирующего электронного микроскопа, FE-SEM, JSM-7401 F, Jeol Ltd., Акисима, Япония.

Активация и инокуляция грибов на питательной среде

Чтобы визуализировать грибковую структуру T. rubrum на микроскопическом уровне, было проведено дифференциальное окрашивание лактофенолом cotton blue с использованием техники импринтинга, которая заключается в нанесении отпечатка поверхности гриба на твердую структуру с помощью клейкой ленты. Затем добавляли 20 мкл красителя и наблюдали образец под микроскопом при 40×.

 Каждый образец композитного материала PUR/AgNPs был выполнен в трех экземплярах с контролем жизнеспособности клеток. Образцы инкубировали при 26° C и относительной влажности не менее 85% в течение как минимум 15 дней, ежедневно регистрируя рост грибка. Процессы получения грибка и их визуализация с помощью лактофенола хлопкового синего проиллюстрированы на рисунке 5.

Рисунок 5. (a) Приготовление культуральной среды и активация грибка, (b) инокуляция грибка на культуральную среду и (c,d) визуализация грибка T. rubrum с использованием лактофенолового хлопкового синего красителя.

Продолжение статьи. Часть 2